2-2- جداسازی عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی از قسمتهای آلوده47
2-2-1- جداسازی جدایههای C. coccodes47
2-2-2- جداسازی استرینهای باکتری R. solanacearum49
2-3- خالصسازی و نگهداری49
2-3-1- خالصسازی و نگهداری جدایههای C. coccodes49
2-3-2- خالصسازی و نگهداری استرینهای باکتری R. solanacearum50
2-4- شناسایی51
2-4-1 – شناسایی Colletotrichum coccodes51
الف- بررسی ویژگیهای ماکروسکوپی51
ب- بررسی ویژگیهای میکروسکوپی51
2-4-2- شناسایی Ralstonia solanacearum52
الف- بررسی خصوصیات فنوتیپی52
2-5- تهیه محیط کشتها و محلولهای مورد استفاده در آزمونهای53
2-5-1- محیط پایه گلوکز- پپتون- آگار53
2-5-2- محیط Ayer’s53
2-5-3- محیط TTC54
2-6- آزمون بیماریزایی54
2-6-1- آزمون بیماریزایی قارچ C. coccodes54
الف- روی میوه گوجهفرنگی54
ب- روی گیاه سیبزمینی55
2-6-2- آزمون بیماریزایی باکتری R. solanacearum55
2-7- تهیه مایه تلقیح55
2-7-1- تهیه اینوکولوم قارچ C. coccodes55
2-7-2- تهیه سوسپانسیون اسپور قارچ C. coccodes56
2-7-3- تهیه سوسپانسیون باکتری R. solanacearum56
2-8- بررسیهای گلخانهای57
2-8-1- تهیه خاک و غده سیبزمینی57
2-8-2- کاشت غدههای سیبزمینی و تلقیح عوامل بیماریزا57
الف- اضافه کردن اینوکولوم قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum به خاک57
ب- آغشتهسازی غدههای سیبزمینی با قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum58
2-8-3- طرح آزمایش و آنالیز نتایج حاصل58
2-9- استخراج DNA ژنومی قارچ C. coccodes59
2-9-1- تولید میسلیوم59
2-9-2 استخراج DNA به روش لی و تیلر60
2-9-3- تعیین کمیت و کیفیت DNA61
2-10- نشانگر RAPD برای بررسی تنوع قارچ C. coccodes62
2-10-1- تنظیم شرایط PCR62
الف- آغازگرهای واکنش RAPD63
ب- dNTPs64
ج- کلرید منیزیم MgCl264
د- بافر PCR (با غلظت 10 برابر)64
ه- آنزیم Taq DNA polymerase64
2-11- الکتروفورز فرآورده‌های تکثیر شده65
2-12- تجزیه و تحلیل داده‌های RAPD65
2-13- استخراج پروتئین باکتری R. solanacearum65
2-13-1- محلولهای مورد نیاز برای استخراج پروتئینهای محلول سلولی باکتری R. solanacearum66
الف- بافر Tris-Hcl 5/1 مولار با pH: 6.866
2-13-2- تهیه بافر استخراج66
2-14- الکتروفورز پروتئینهای محلول سلولی باکتری R. solanacearum67
2-14-1- تهیه ژل اکریلآمید67
الف- ژل زیرین67
ب- ژل بالایی68
2-14-2- بافر تانک68
2-15- رنگآمیزی ژل اکریلآمید69
2-15-1- تهیه محلول رنگآمیزی69
2-16- رنگبری ژل اکریلآمید69
2-16-1- تهیه محلول رنگبر69
2-17- نگهداری ژل69

فصل سوم: نتایج و بحث
3-1- جداسازی و شناسایی70
3-1-1 – قارچ Colletotrichum coccodes70
الف- ریخت شناسی پرگنه70
ب- ویژگیهای میکروسکوپی71
3-1-2- باکتری Ralstonia solanacearum73
الف- تستهای فنوتیپی73
ب- واکنش فوق حساسیت در توتون74
3-2- آزمون بیماریزایی75
3-2-1- آزمون بیماریزایی قارچ C. coccodes75
3-2-2- آزمون بیماریزایی باکتری R. solanacearum78
3-3- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum79
3-3-1- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم آگریا83
الف- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ساقه سیبزمینی رقم آگریا83
ب- اثرمتقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ریشه سیبزمینی رقم آگریا85
ج- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ساقه سیبزمینی رقم آگریا86
د- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ریشه سیبزمینی رقم آگریا87
ه- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ساقه سیبزمینی رقم آگریا87
و- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ریشه سیبزمینی رقم آگریا88
ز- اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes89
ح- بحث در مورد بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم آگریا90
3-3-2- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم بورن91
الف- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ساقه سیبزمینی رقم بورن91
ب- اثرمتقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ریشه سیبزمینی رقم بورن92
ج- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ساقه سیبزمینی رقم بورن94
د- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ریشه سیبزمینی رقم بورن95
ه- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ساقه سیبزمینی رقم بورن96
و- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ریشه سیبزمینی رقم بورن97
ز- اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت C. coccodes98
ح- بحث در مورد بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم بورن99
3-3-3- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم دیامانت100
الف- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ساقه سیبزمینی رقم دیامانت100
ب- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ریشه سیبزمینی رقم دیامانت102
ج- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ساقه سیبزمینی رقم دیامانت102
د- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ریشه سیبزمینی رقم دیامانت103
ه- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ساقه سیبزمینی رقم دیامانت104
و- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ریشه سیبزمینی رقم دیامانت105

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

ز- اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes106
ح- بحث در مورد بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم دیامانت106
3-3-4- بحث کلی راجع به اثر متقابل R. solanacearum و C. coccodes در گیاه سیبزمینی107
3-4- بررسیهای ژنتیکی110
3-4-1- بررسیهای مولکولی110
الف- نشانگر RAPD111
3-4-2- بررسیهای بیوشیمیایی باکتری R. solanacearum115
الف- SDS-PAGE115
3-5- پیشنهادها117
پیوست…………………………………………. …………………………………………………………………………………………………….118
منابع124
جدول 1-1- اسامی و موقعیت تاکسونومیکی R. solanacearum 7
جدول 1-2- اسامی و موقعیت تاکسونومیکی C. coccodes27
جدول 2-1- مناطق نمونهبرداری شده برای جداسازی قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum48
جدول 2-2- تیمارهای مورد آزمایش در بررسی اثر متقابل قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum59
جدول 2-3- مواد لازم و مقدار آنها جهت تهیه محلول پایه برای واکنش PCR62
جدول 2-4- زمان و دمای مورد نیاز برای مراحل مختلف PCR63
جدول 2-5- لیست آغازگرهای مورد استفاده در نشانگر RAPD64
جدول 2-6- مواد لازم جهت تهیه Mix? به منظور استخراج پروتئین باکتری R. solanacearum66
جدول 3-1- خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی استرینهای باکتری R. solanacearum73
جدول 3-2- آزمونهای تعیین بیووار باکتری R. solanacearum74
جدول 3-3- آزمون بیماریزایی جدایههای قارچ C. coccodes روی میوه گوجهفرنگی و آنالیز آماری نتایج آن76
جدول 3-4- جدول مقایسه میانگین اثر جدایههای قارچ C. coccodes و استرینهای باکتری R. solanacearum80
جدول 3-5- جدول مقایسه میانگین اثر جدایههای قارچ C. coccodes و استرینهای باکتری R. solanacearum81
جدول 3-6- جدول مقایسه میانگین اثر جدایههای قارچ C. coccodes و استرینهای باکتری R. solanacearum82
جدول 3-7- جدول مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum84
جدول 3-8- جدول مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum93
جدول 3-9- جدول مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum101
جدول 3-10- تعداد باندهای ایجاد شده توسط آغازگرهای به کار رفته در نشانگر RAPD در جدایههای قارچ
C. coccodes112
شکل 3-1- علائم قارچ C. coccodes روی ریشه سیبزمینی و پرگنه قارچ روی محیط کشت71
شکل 3-2- تصاویر میکروسکوپی از Colletotrichum coccodes، کنیدیومها، میکرواسکلروت و موها، اپرسوریوم72
شکل 3-3- تصاویر مربوط به آزمون فوق حساسیت باکتری R. solanacearum در توتون75
شکل 3-4- نمودار تعداد لکههای ایجاد شده روی میوه گوجهفرنگی ناشی از جدایههای قارچ C. coccodes77
شکل 3-5- نمودار قطر لکههای ایجاد شده روی میوه گوجهفرنگی ناشی از جدایههای قارچ C. coccodes77
شکل 3-6- آزمون بیماریزایی قارچ C. coccodes78
شکل 3-7- آزمون بیماریزایی باکتری R. solanacearum79
شکل 3-8- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی طول ساقه در سیبزمینی………83
شکل 3-9- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی طول ریشه سیبزمینی85
شکل 3-10- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن تر ساقه سیبزمینی86
شکل3-11- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن تر ریشه سیبزمینی87
شکل 3-12- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن خشک ساقه88
شکل 3-13- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن خشک ریشه89
شکل 3-14- نمودار اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه گیاه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes90
شکل 3-15- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی طول ساقه سیبزمینی92
شکل 3-16- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی طول ریشه سیبزمینی94
شکل 3-17- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن تر ساقه سیبزمینی95
شکل 3-18- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن تر ریشه سیبزمینی96
شکل 3-19- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن خشک ساقه97
شکل 3-20- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن خشک ریشه98
شکل 3-21- نمودار اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه گیاه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes……99
شکل 3-22- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی طول ساقه سیبزمینی100
شکل 3-23- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی طول ریشه سیبزمینی102
شکل 3-24- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن تر ساقه سیبزمینی103
شکل 3-25- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن تر ریشه سیبزمینی104
شکل 3-26- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن خشک ساقه105
شکل 3-27- نمودار اثر R. solanacearum و C. coccodes به تنهایی و همراه با هم روی وزن خشک ریشه106
شکل 3-28- نمودار اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه گیاه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes107
شکل 3-29- غلظت سنجی DNA جدایههای مختلف قارچ C. coccodes روی ژل آگارز در مقایسه با DNA فاژ ?.110
شکل 3-30- نتیجه RAPD با آغازگر OPA-13 در جدایههای مختلف قارچ C. coccodes 111
شکل 3-31- نتیجه RAPD با استفاده از آغازگر OPZ-07 در جدایههای مختلف قارچ C. coccodes112
شکل 3-32- مقایسه جدایههای مختلف C. coccodes با نشانگر RAPD با رسم دندروگرام114
شکل 3-33- الگوی الکتروفورز پروتئینهای محلول سلولی استرینهای R. solanacearum جدا شده از سیبزمینی در ژل پلیاکریلآمید 12%116
مقدمه
الف- تاریخچه گیاه سیبزمینی
سیبزمینی بومی امریکای جنوبی بوده و منشاء آن کشور پرو و بولیوی میباشد و برای اولین بار حدود 7000 سال پیش در پرو کاشته شده است. بنا به باور باستانشناسان، سیبزمینی از حدود 2000 سال پیش از میلاد مسیح توسط اینکاها در بخشهای کوهستانی این کشور کاشته شده است. این گیاه در سال 1573 وارد اسپانیا شد و به عنوان یک منبع غذایی مورد توجه قرار گرفت و به تدریج از اسپانیا به دیگر کشورهای اروپایی برده شد. تا حدود 150 سال سیبزمینی تنها در مناطق محدودی از اروپا در کاخهای سلطنتی و باغچه خانهها کاشته میشد. در سال 1719 از اروپا به امریکای شمالی و سپس به آسیا برده شد. تاریخچه کشت این گیاه در قاره افریقا به حدود 50 سال پیش برمیگردد. حدود 200 سال پیش (در زمان فتحعلیشاه قاجار) مقداری بذر سیبزمینی به ایران آورده شد. این بذرها ابتدا در یکی از روستاهای تهران کاشته شده و سپس به فریدن اصفهان و به تدریج به سایر نقاط کشور برده و کشت شد (شجاعی، 1383).

ب- مشخصات گیاهشناسی
سیبزمینی گیاهی دولپه، یکساله و از خانواده Solanaceae میباشد. برگها مرکب، گلها پنج قسمتی و دارای رنگهای متفاوتی هستند. میوهها گرد تا تخممرغی (قطر 3-1 سانتیمتر یا بیشتر)، سبز رنگ، سبز متمایل به قهوهای یا قهوهای بوده و به هنگام رسیدن قرمز تا بنفش رنگ
میشوند و حاوی بیش از 200 تا 300 بذر هستند. ساقه معمولاً سبز رنگ است اما گاهی قرمز یا بنفش، زاویهدار، علفی و در اواخر فصل در قسمتهای پایینی نسبتاً چوبی میشود. ریشهها منشعب و نیمه عمیق هستند که حداکثر عمق فعالیت آنها 60 سانتیمتر میباشد ( هوکر1، 1990). لقاح در این گیاه به صورت خودگشنی است و از لحاظ زمان رسیدن به ارقام زودرس، میانرس و دیررس تقسیم میشود.
اغلب گونههایی که به طور معمول مورد کشت قرار میگیرند تتراپلوئید
(2n=4x=48 کروموزوم) هستند. همچنین چهار گونه دیپلوئید (24 کروموزوم)، دو گونه تریپلوئید (36 کروموزوم) و یک گونه پنتاپلوئید (60 کروموزوم) نیز گاهی مورد کشت قرار
میگیرند. مهمترین گونهای که در سراسر جهان کشت میشود Solanum tuberosum میباشد که یک گونه تتراپلوئید است و دارای دو زیر گونه andigena و tuberosum میباشد. زیر گونه andigena با طول روز کوتاه سازگاری پیدا کرده و زیر گونه tuberosum با طول روز بلند سازگار است. بررسیهای ژنتیکی نشان دادهاند که 32 رقم مورد کشت در هند از زیر گونه tuberosum به دست آمدهاند.
ج- شرایط محیطی
سیبزمینی به طور مشخص متعلق به مناطق معتدل سرد با ارتفاع تقریبی 2000 متر یا ارتفاعات بالاتر در مناطق گرمسیری است. این گیاه به شبهای خنک و خاک دارای زهکشی مناسب و رطوبت کافی نیاز دارد و در عرضهای جغرافیایی پایین در مناطق گرم تولید خوبی ندارد (هوکر، 1990). خاک لومی- شنی حاصلخیز برای این گیاه مناسب است. دمای مناسب برای رشد 20-15 درجه سانتیگراد است و دمای بالای 29 درجه تولید غده را کاهش میدهد. این محصول تا انتهای دوره رشد به 9-7 بار آبیاری نیاز دارد.

د- اهمیت اقتصادی و سطح زیر کشت
سیبزمینی مهمترین گیاه دولپهای است که به عنوان منبع غذایی انسانها مورد استفاده قرار میگیرد. این گیاه بعد از گندم، برنج و ذرت چهارمین محصول مهم غذایی در جهان است. میزان تولید ماده خشک سیبزمینی در واحد سطح به ترتیب 04/3، 68/2 و 12/1 برابر از گندم، جو و ذرت بیشتر است. مقدار پروتئین آن نیز بیشتر از گندم، جو و ذرت میباشد.
طبق آمار سازمان خوار و بار جهانی کشاورزی (FAO)2 در سال 2007، میزان تولید کل
سیبزمینی در جهان 321736483 تن گزارش شده که بیشترین سهم مربوط به چین3 با 72040000 تن و کمترین میزان مربوط به بنین4 با تولید 30 تن میباشد. سهم ایران 5240000 تن میباشد. در قاره آسیا تولید کل 135607646 تن بوده و چین و بحرین به ترتیب بیشترین و کمترین تولید را دارا هستند.
طبق گزارش آمارنامه کشاورزی ایران سطح زیر کشت، تولید و عملکرد سیبزمینی در سال زراعی 84-83 به قرار زیر میباشد:

عملکرد (کیلوگرم) تولید (تن) سطح زیر کشت (هکتار) دیم آبی دیم آبی دیم آبی 75/5712 63/25762 59/15848 25/4814275 3/2774 5/186870 جمع 38/31475 14/4830124 8/189644
در استان همدان سطح زیر کشت سیبزمینی 3/26517 هکتار است که تماماً به صورت آبی کاشته میشود. میزان تولید 77/966016 تن و عملکرد 68/36429 کیلوگرم میباشد.
ه- بیماریهای سیبزمینی
هر گیاهی در طول دوره رشد خود دستخوش آسیبهای مختلف ناشی از شرایط محیطی نامناسب (آب و هوا، نور، رطوبت و خاک)، حمله آفات و عوامل بیماریزا (قارچ، باکتری، ویروس، نماتد و مایکوپلاسما) میباشد. در واقع بیماری به برهمکنش بین میزبان و بیمارگر گفته میشود که تولید و قابلیت استفاده محصول را دچار مشکل میکند. شرایط محیطی نامساعد حتی در غیاب عامل بیماریزا به تنهایی برای صدمه به گیاه کفایت میکند.
گیاه سیبزمینی نیز از این آسیبها در امان نیست. تحت تأثیر عوامل محیطی و ژنتیکی و نوع رقم، ممکن است میزان محصول، اندازه غدهها و بازارپسندی آنها کاهش یابد. عوامل قارچی، باکتریایی، ویروسی، مایکوپلاسمایی و نماتدهای زیادی به سیبزمینی حمله میکنند. برای مثال در سال 1845 بیماری لیت بلایت5 ناشی از قارچ Phytophthora infestans به سرعت در غرب ایرلند گسترش یافت و باعث از بین رفتن قسمت اعظم محصول سیبزمینی شده و قحطی شدیدی را در پی داشت.
از جمله بیماریهای قارچی مهم میتوان به شانکر رایزوکتونیایی ناشی از
Rhizoctonia solani، پژمردگیهای فوزاریومی و پوسیدگی ریشه فوزاریومی ناشی از گونههای Fusarium، پژمردگی ورتیسیلیومی ناشی از Verticillium albo-atrum، پوسیدگی ساقه ناشی از Sclerotium rolfsii، کپک سفید ناشی ازSclerotinia sclerotiorum، پوسیدگی صورتی با عامل Phytophthora erythroseptica، لکه موجی ناشی از Alternaria solani و خال سیاه ناشی از Colletotrichum coccodes اشاره کرد.
باکتریهای Pectobacterium carotovorum pv.carotovorum عامل ساق سیاه،
Erwinia spp. عامل ایجاد پوسیدگی نرم، Streptomyces scabies عامل جرب پودری و
Ralstonia solanacearum عامل پژمردگی باکتریایی از جمله عوامل باکتریایی زیانآور
سیبزمینی هستند.
نماتد طلایی سیبزمینی (Globodera rostochinensis)، نماتد مولد زخم غده (Pratylenchus penetrans) و ویروس X سیبزمینی از جمله دیگر عوامل بیماریزا به شمار میآیند.

و- اهمیت موضوع تحقیق
ازآنجاکه استان همدان یکی از مراکز مهم سیبزمینیکاری کشور محسوب میشود و قارچ
C. coccodes و باکتری R. solanacearum از عوامل بیماریزای مهم این گیاه در این منطقه هستند، انجام تحقیقی پیرامون آنها ضروری به نظر رسید. این عوامل در مزارع سیبزمینی استان وجود داشته و خسارات قابل توجهی را به این محصول وارد میسازند. به دلیل اینکه تکثیر
سیبزمینی با استفاده از غده صورت میگیرد و همچنین این دو بیمارگر توسط غده نیز منتقل
میشوند و احتمال آلودگی خاک نیز حتماً وجود دارد، بسته به شرایط، بیماریهای مذکور تقریباً هر ساله خسارت زیادی به محصول سیبزمینی وارد میسازند. همانطورکه میدانیم گیاه در یک زمان میتواند تحت تأثیر عوامل بیماریزای مختلف قرار گیرد. حضور یک بیمارگر به همراه سایر عوامل بیماریزا در گیاه ممکن است اثراتی روی یکدیگر داشته باشند. پیرامون این موضوع تحقیقات متعددی در دنیا انجام شده که به مواردی از آنها اشاره میشود. برهمکنش بین چهار عامل R. solani، V. dahliae، C. coccodes و Pratylenchus penetrans میزان کلونیزاسیون بافتهای ریشه و ساقه را تحت تأثیر قرار میدهد (کاتکان6 و همکاران، 1985). بر اساس مطالعات صورت گرفته توسط تسرور7 و هازانوفسکی8 (2001)، تلقیح همزمان C. coccodes و
V. dahliae روی ایجاد علائم در ارقام مختلف سیبزمینی اثرات متفاوتی داشته است.
در ادامه این بررسیها و به منظور آگاهی از وجود یا عدم وجود چنین روابطی بین قارچ و باکتری مورد نظر تصمیم بر انجام این تحقیق گرفته شد. دانستن این موضوع میتواند تا حدی در مدیریت بیماری و به تبع آن کاهش خسارت و هزینهها موثر باشد و لزوم استفاده از غدههای عاری از آلودگی، کشت در خاک بدون آلودگی و استفاده از آب سالم را گوشزد نماید.
افزایش استفاده از تکنیکهای بیولوژی مولکولی در بیماریشناسی گیاهی در چند سال گذشته باعث افزایش تعداد مقالات در نشریات قارچشناسی و بیماریشناسی گیاهی شده که حاوی اطلاعات زیادی راجع به تغییرات ژنتیکی بیمارگرهای گیاهی هستند. تقریباً همه بیمارگرهای گیاهی دارای تنوع درونگونهای و بینگونهای هستند. این تنوع با تکنیکهای مختلف قابل بررسی است. این تکنیکها به سه دسته تقسیم میشوند: روشهای مبتنی بر ویژگیهای ظاهری،
روشهای مبتنی بر DNA و روشهای مبتنی بر پروتئین.
SDS-PAGE9 یکی از روشهای مورد استفاده در بررسیهای مولکولی است و برای تفکیک زیرواحدهای پروتئینی و فرآوردههای حاصل از پیسیآر10 استفاده میشود. به منظور بررسی الگوی پروتئینی موجودات مختلف، پروتئین آنها استخراج و در ژل پلیاکریل آمید در میدان الکتریکی قرار داده میشود. پروتئینها بر اساس وزن مولکولی در داخل ژل از هم جدا میشوند. پس از طی مراحل مختلف اعم از رنگآمیزی و رنگبری، باندهای پروتئینی در ژل قابل روئیت بوده و میتوان آنها را مورد بررسی قرار داد.
به منظور بررسی تنوع درونگونهای قارچ C. coccodes از نشانگر مولکولی RAPD استفاده شد. RAPD کاربرد زیادی در مطالعات مولکولی دارد و از لحاظ اقتصادی به صرفه میباشد.
1- بررسی منابع
1-1- باکتری Ralstonia solanacearum
1-1-1- مقدمه
بیشتر از صد سال از زمان چاپ اولین توصیف کامل راجع به باکتریRalstonia solanacearum E.F. Smith، عامل پژمردگی گیاهان خانواده سولاناسه، توسط اسمیت11 میگذرد (اسمیت، 1896). در آن زمان اسمیت کاملاً متوجه اهمیت جهانی این باکتری نشده بود. با وجود این، او اولین شخصی بود که مشکلی را که بسیاری از محققین در مطالعه عامل بیماری در محیط کشت با آن مواجه بودند را حل کرد. به دنبال آن و با گذشت سالها بیش از 2000 مقاله در مورد این باکتری به زبانهای مختلف به چاپ رسیده است. طبق گزارش OEPP/EPPO در سال 2004، این باکتری برای اولین بار اواخر قرن نوزدهم از روی سیبزمینی، توتون، گوجهفرنگی و بادامزمینی از آسیا، امریکای جنوبی و جنوب ایالات متحده گزارش شد. چندین مقاله مروری که در برگیرنده بیولوژی، اپیدمیولوژی، برهمکنش بین میزبان و بیمارگر و ژنتیک R. solanacearum هستند توسط محققینی مثل بادنهاگن12 (1986)، هیوارد13 (1991)، بوچر14 و همکاران (1992) و دنی و شل15 (1992) به چاپ رسیده است.
اگرچه تخمین زیانهای اقتصادی وارد آمده توسط پژمردگی باکتریایی به صورت مستقیم و غیر مستقیم درگذشته و حال مشکل است، اما این بیماری اگر مهمترین بیماری باکتریایی نباشد، در زمره مهمترین آنها در جهان قرار میگیرد. هیچ بیماری باکتریایی از لحاظ تعداد واقعی محصولاتی نظیر موز، بادامزمینی، سیبزمینی، توتون و گوجهفرنگی که هر ساله توسط این باکتری از بین میروند، مشابه این بیماری نیست. علاوه بر این، تعداد کمی از بیماریهای قارچی و ویروسی از لحاظ تنوع، دامنه میزبانی، پراکنش جغرافیایی و اهمیت اقتصادی قابل مقایسه با آن هستند.
منشاء این بیمارگر هنوز به صورت قطعی مشخص نشده است. بیماری حدود 200 سال قبل از توصیف آن، توسط کشاورزان ژاپنی شناخته شد. تشخیص اولیه باکتری در بسیاری از مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری به دنبال تخریب جنگل ویرجین و کشت گیاهان خانواده Solanaceae نظیر سیبزمینی و توتون در آن زمینها صورت گرفت. از آنجائیکه اکثر
استرینهای باکتری به دمای پایین حساس هستند، پراکنش باکتری محدود به مناطق مهم کشت سیبزمینی در جهان شده است; البته توجه به گسترده شدن محدوده پراکنش باکتری به دلیل وجود استرینهای متحمل به دمای نسبتاً پایین، ما را به سمت انجام اقدامات مناسب جهت تضمین آینده تولید سیبزمینی سوق میدهد (کلمن و همکاران16، 1994).
1-1-2- اسامی و موقعیت تاکسونومیکی
جدول 1-1- اسامی و موقعیت تاکسونومیکی R. solanacearum ( به نقل از دانکل17، 2007 )
سلسلهBacteriaشاخهProteobacteriaرده BetaproteobacteriaراستهBurkholderialesخانواده RalstoniaceaeاسترینRalstonia solanacearum (Smith, 1896)
Yabuuchi, et al.1995 (race 3, biovar 2)اسامی مشابه Bacillus solanacearum (Smith), 1896
Phytomonas solanacearum (Smith) Bergy et al., 1897
Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, 1914
Burkholderia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., 1992
اسامی معمول پذیرفته شدهپژمردگی باکتریایی (فلفل، سیبزمینی، گوجهفرنگی)، پژمردگی جنوبی (شمعدانی)، پوسیدگی قهوهای (سیبزمینی)دیگر اسامی معمولپژمردگی باکتریایی سیبزمینی، پژمردگی باکتریایی گیاهان خانواده سولاناسه، پوسیدگی قهوهای سیبزمینی، پوسیدگی قهوهای گیاهان خانواده سولاناسه، سوختگی جنوبی باکتریایی گوجهفرنگی، سوختگی جنوبی باکتریایی (2003، CABI)
1-1-3- خصوصیات
R. solanacearumیک بیمارگر خاکزاد است که عامل مهمی در محدود کردن تولید بسیاری از گیاهان در سرتاسر جهان میباشد و عامل پژمردگی باکتریایی و پوسیدگی قهوهای سیبزمینی، پژمردگی باکتریایی یا پژمردگی جنوبی گوجهفرنگی، بادمجان، توتون و بعضی از گیاهان زینتی و همچنین بیماری موکوی موز است (اگریوس18، 1997). استرین بیماریزای سیبزمینی روی توتون بیماریزایی ضعیفی دارد و روی موز غیربیماریزا است. استرین مربوط به موز هم نمیتواند روی سیبزمینی ایجاد بیماری کند. در مقابل، استرینهای بیمارگر گوجهفرنگی و توتون معمولاً قادر به بیمار کردن سیبزمینی هستند (هوکر، 1990).
R. solanacearum یک باکتری گرم منفی، غیرفلورسنت، میلهای شکل و هوازی اجباری است که اندازهای بین 7/0 – 5/0 در 2 – 5/1 میکرومتر دارد و دارای یک تاژک قطبی و فاقد کپسول و اسپور است. دمای بهینه رشد برای اکثر استرینها بین 32 – 28 درجه سانتیگراد میباشد (هیوارد، 1991؛ شاد19 و همکاران، 2001). کلونی باکتری روی سطح آگار و در دمای 28 درجه سانتیگراد معمولاً بعد از گذشت 48 – 36 ساعت ظاهر میشود. کلونیهای تیپ بیماریزا سفید یا کرم رنگ، دارای شکل نامنظم، لعابدار و مات هستند. در اثر ایجاد موتاسیون کلونیهای غیربیماریزا هم ظاهر میشوند که شکل منظمی دارند، کوچکتر و فاقد لعاب هستند. محیط TTC20 (کلمن، 1954) قادر به جداسازی این دو تیپ کلونی از یکدیگر است; در واقع روی این محیط کلونیهای بیماریزا به رنگ سفید با مرکز صورتی و کلونیهای غیربیماریزا به رنگ قرمز تیره هستند (چامپویزو21 و همکاران، 2009).
R. solanacearum سالها در آب معمولی، آب مقطر و یا آب دیونیزه استریل زنده میماند. همچنین نگهداری باکتری به مدت طولانی در محیط کشت مایع حاوی 10% گلیسرول و در دمای 80- درجه سانتیگراد امکانپذیر است. کشت متوالی روی سطح آگار باعث از بین رفتن قدرت بیماریزایی بیمارگر شده و باکتری روی سطح محیط کشت و در دمای 4 درجه سانتیگراد قادر به زنده ماندن نیست. این باکتری در شرایط خاصی مثل قرار گرفتن در معرض دماهای پایین، وارد یک حالت زنده اما غیرقابل کشت میشود (VBNC22) که ممکن است روشهای تشخیصی مبتنی بر کشت را با مشکل مواجه کند (ونالساس23 و همکاران، 2001).
کاتالاز، اکسیداز و نیتراترداکتاز در این باکتری مثبت است، نشاسته و اسکولین را هیدرولیز
نمیکند، به سختی قادر به هیدرولیز ژلاتین است، از سوکروز تولید لوان نمیکند، در 41 درجه سانتیگراد رشد نمیکند، در 8 pH: ضعیف و در 4 pH: و 9 pH: اصلاً رشد نمیکند. در غلظت نمک بالای 2% قادر به رشد نیست.

1-1-4- بیماریزایی R. solanacearum


پاسخ دهید